Cellular cyclic AMP Detection KIT

      Cellular cyclic AMP Detection KIT是一种竞争性的检测技术，检测细胞内cAMP的量。药物同贴壁细胞或者悬浮细胞共处理后，能通过此KIT检测出药物对细胞的作用。
 

      检测原理采用TR-FRET检测技术。细胞内天然的cAMP同cAMP-Probe竞争性结合Eu -Anti-cAMP。最终检测出来的信号与样本中cAMP的浓度成反比。
 

      荧光比值665nm/620nm可以消除背景信号的干扰，意味着检测不受实验培养基条件（例如培养基、血清、生物素、有色化合物等）的影响。

1. 384浅孔板：Greiner#784075，PerkinElmer# Proxiplate 6008280，也可以应用于96孔板和1536微孔板。
 

2. 酶标仪：BMG  PHERAstar ，PerkinElmer Envision.
 

3. IBMX(Sigma#I5879-1G) 是最常用的磷酸二酯酶泛抑制剂，它能保证细胞中 cAMP 的高水平积累而不被降解。 
 

4. Foskolin(MCE#HY-15371) 可激活腺苷酸环化酶并增加细胞内 cAMP 水平，它可用作 Gs 应用的阳性对照。Forskolin也可以用作Gi 偶联受体研究。

1. Stimulation Buffer :取1体积的Stimulation Buffer，加上4体积的ddH2O，稀释5倍，1X的 Stimulation Buffer现配现用。
 

2.检测试剂的配制：（1）cAMP-Probe (100X) 取1体积的cAMP-Probe，加上99体积的Lysis & Detection Buffer，稀释100倍备用。（2）Eu -Anti-cAMP (100X)取1体积的Eu -Anti-cAMP，加上99体积的Lysis & Detection Buffer，稀释20倍备用。
 

3. IBMX: 用DMSO配制IBMX的stock 溶液0.5M，常用的工作浓度是0.5mM，用1X的Stimulation Buffer稀释1000倍，现配现用。
 

4. Forskolin: 用DMSO配制Forskolin的stock 溶液10mM，根据实验需要，可以用1X的Stimulation Buffer稀释成不同的浓度备用。

      测试标准品的反应曲线，以确定实验室中Stimulation Buffer或者细胞培养基的检测线性动态范围。这还将验证实验中是否产生了预期的 S/B 和 cAMP的IC50值。
 

      特别是IC10 和 IC90的数值将在实验中非常有用，可以用于优化细胞系的细胞密度。
 

      测试标准品的反应曲线，以确定实验室中Stimulation Buffer或者细胞培养基的检测线性动态范围。这还将验证实验中是否产生了预期的 S/B 和 cAMP的IC50值。
 

      特别是IC10 和 IC90的数值将在实验中非常有用，可以用于优化细胞系的细胞密度。
 

计算每个孔的受体和供体发射信号的比例

Ratio=665nm的信号值/620nm的信号值, 四参数拟合曲线如下图
 

1. 必须优化各种细胞参数，这些参数取决于要筛选的化合物的类型（激动剂或拮抗剂）以及要筛选的GPCR 的G 蛋白类型（Gs或 Gi）。这些参数包括细胞密度、IBMX 浓度、激动剂浓度（用于拮抗剂筛选）和药物刺激时间。
 

2. 必须优化细胞密度，以确保刺激细胞的 cAMP 水平在测定的线性动态范围内（IC10 至 IC90）。如果结果超出测定的线性范围，数据将不准确。
 

3.化合物建议在1X的Stimulation Buffer 中稀释，对于超过 2 小时的刺激时间，化合物可以在细胞培养基中稀释。

计算每个孔的受体和供体发射信号的比例

Ratio=665nm的信号值/620nm的信号值