hCov-NL63-ORF1ab/RdRP Pseudovirus Standard Reference

CBV30017

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I. 背景
hCov-NL63最早是在2004年初在荷兰从一个7个月大的婴儿中从吸出物中分离出来的。此后，HCoV-NL63的感染已被证明是世界范围内普遍存在的疾病，并与许多临床症状有关。诊断包括严重的下呼吸道感染，臀部炎和细支气管炎。HCoV-NL63引起儿童疾病，老年人和免疫功能低下的儿童，在儿童呼吸道感染中占1.0-9.3％。根据CDC和WHO的介绍，针对HCoV-NL63的核酸诊断一般是针对RdRP (RNA-dependent RNA polymerase)、Gene N和Gene E， Gene S更多用于对应药物和疫苗的开发。NCBI收录序列为JX504050.1，全长27553bp，基因编码4个结构蛋白：S，M，N和E。以往针对试剂盒检测限的性能评价，一般是选择体外转录的RNA、或者临床阳性病毒来作为标准品，用于性能评价。但是两者都具有很明显的确定，首先体外转录的RNA，一般是很纯，单一，不涉及提取，不符合临床病毒的微环境，因此必然造成检测灵敏度被高估，这也是存在高概率假阴性的主要原因；再次临床阳性病毒，即使是灭活的病毒，也是存在很大的生物安全隐患，因此要求实验室级别为P3-P4，大部分开发诊断试剂盒单位都不满足改要求，另外临床阳性病毒也是来源很有限，不能被稳定供应，反复用于试剂盒的性能评价。

II.产品描述
有病毒的完整包膜结构，有HCoV-NL63对应的核酸序列，但是生物安全风险较低的假病毒标准品，完美的克服了选择体外转录的RNA、或者临床阳性病毒来作为标准品的缺点，非常适合用于核酸诊断性能评价的标准品。构建过程：HCoV-NL63基因合成→假病毒包装→纯化→QC检测（ddPCR）

III. 产品介绍
产品名称:	hCov-NL63-ORF1ab/RdRP Pseudovirus Standard Reference
对应序列（详情见附录）:	ORF1ab/RdRP（2780bp）
产品规格:	1ml
拷贝数:	>1x10e7copies/ml
生物安全级别:	P2
运输与保存方式:	干冰运输，-90 ~ -70°C保存
有效期:

IV. 产品用途与优势
产品用途:	HCoV-NL63诊断试剂盒性能评价
产品优势:	•HCoV-NL63的假病毒标准品，区别于以往体外合成的RNA、临床阳性活病毒，完美克服两者的缺点，真正适合用于试剂盒的性能评价，包含检测限、特异性，重复性等； • 根据HCoV-NL63冠状病毒的特点，选取了ORF1ab/RdRP（RNA-dependent RNA polymerase）、Gene E(envelope protein)、Gene N(nucleocapsid phosphoprotein)合计3个区段的序列，用于假病毒的包装，3个区段很好的表征了HCoV-NL63的特征序列； • 公海赌赌船官网jc710设计了ddPCR体系的引物、探针序列，可不需要构建标准曲线的前提下完成对假病毒的QC拷贝数检测，非常准确表征标准品的拷贝数，而且克服了Q-PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性； • 假病毒标准品，无致病性，可再生，质控方法可靠，批次间稳定，可以长期稳定制备和供应，而且要求实验室生物安全级别为P2，满足很多单位的安全需求。

Ⅴ. 附录
ORF1ab/RdRP: 1 agtgttgaca tttcttattt aaacgagcaa ggggttctag tgcagctcga ctagaaccct 61 gtaatggcac ggacatcgat aagtgtgttc gtgcttttga catttataat aaaaatgttt 121 cattcttggg taagtgtttg aagatgaact gtgttcgttt taaaaatgct gatcttaagg 181 atggttattt tgttataaag aggtgtacta agtcggttat ggaacacgag caatccatgt 241 ataacctact taacttttct ggtgctttgg ctgagcatga tttctttact tggaaagatg 301 gcagagtcat ttatggtaat gttagtagac ataatcttac taaatatact atgatggact 361 tggtctatgc tatgcgtaac tttgatgaac aaaattgtga tgttctaaaa gaagtattag 421 ttttaactgg ttgttgtgac aattcttatt ttgatagtaa gggttggtat gacccagttg 481 aaaatgaaga tatacataga gtttatgcat ctcttggcaa aattgtagct agagctatgc 541 ttaaatgcgt tgctctatgt gatgcgatgg ttgctaaagg tgttgttggt gttttaacat 601 tagataacca agatcttaat ggtaactttt atgattttgg tgattttgtt gttagcttac 661 ctaatatggg tgttccctgt tgtacatcat attattctta tatgatgcct attatgggtt 721 taactaattg tttagctagt gagtgttttg tcaagagtga tatttttggt agtgatttta 781 aaacttttga tttgcttaag tatgatttca ctgaacataa agaaaattta ttcaataagt 841 actttaagca ttggagtttt gattatcatc ctaattgtag tgactgttat gatgatatgt 901 gtgttataca ttgtgctaat tttaatacac tatttgctac aactatacca ggtactgctt 961 ttggtccact atgtcgtaaa gtttttatag atggtgttcc acttgttaca actgctggtt 1021 atcattttaa gcaattaggt ttggtttgga ataaagatgt taacacacac tcagttaggt 1081 tgacaattac tgaacttttg caatttgtca ccgacccttc cttgataata gcttcttccc 1141 cagcactcgt tgatcaacgc actatttgtt tttctgttgc agcattgagt actggtttga 1201 caaatcaagt tgttaagcca ggtcatttta atgaagagtt ttataacttt cttcgtttaa 1261 gaggtttctt tgatgaaggt tctgaactta cattaaaaca tttcttcttc gcacagaatg 1321 gtgatgctgc tgttaaagat tttgactttt accgttataa taagcctacc attttagata 1381 tttgtcaagc tagagttaca tataagatag tctctcgtta ttttgacatt tatgaaggtg 1441 gctgtattaa ggcatgtgaa gttgttgtaa caaatcttaa taagagtgct ggttggccat 1501 taaataagtt tggtaaagct agtttgtatt atgaatctat atcttatgaa gaacaggatg 1561 ctttgtttgc tttgacaaag cgtaatgtcc tccctactat gacacagctg aatcttaagt 1621 atgctattag tggtaaagaa cgtgctagaa ctgttggtgg tgtttctctg ttgtctacaa 1681 tgaccacaag acaataccat caaaaacatc ttaaatccat tgttaataca cgcaatgcca 1741 ctgttgttat tggtactacc aaattttatg gtggttggaa taatatgttg cgtactttaa 1801 ttgatggtgt tgaaaaccct atgctcatgg gttgggatta tcccaaatgt gatagagctt 1861 tgcctaacat gatacgtatg atttcagcca tggtgttggg ctctaagcat gttaattgtt 1921 gtactgcaac agataggttt tataggcttg gtaatgagtt ggcacaagtt ttaacagaag 1981 ttgtttattc taatggtggt ttttatttta agccaggtgg tacgacttct ggtgacgcta 2041 gtacagctta tgctaattct atttttaaca tttttcaagc cgtgagttct aacattaaca 2101 ggttgcttag tgtcccatca gattcatgta ataatgttaa tgttagggat ctacaacgac 2161 gtctgtatga taattgctat aggttaacta gtgttgaaga gtcattcatt gatgattatt 2221 atggttatct taggaaacat ttttcaatga tgattctctc tgatgacggt gttgtctgtt 2281 ataacaagga ttatgctgag ttaggttata tagcagacat tagtgctttt aaagccactt 2341 tgtattacca gaataatgtc tttatgagta cttctaaatg ttgggttgaa gaagatttaa 2401 ctaagggacc acatgagttt tgttcccagc atactatgca aatagttgac aaagatggta 2461 cctattattt gccttaccca gatcctagta ggatcttgtc agctggtgtt tttgttgatg 2521 atgttgttaa gacagatgct gttgttttgt tagaacgtta tgtgtcttta gctattgatg 2581 cataccctct ttcaaaacac cctaattctg aatatcgcaa ggttttttac gtattacttg 2641 attgggttaa gcatcttaac aaaaatttga atgagggtgt tcttgaatct ttttctgtta 2701 cacttcttga taatcaagaa gataagtttt ggtgtgaaga tttttatgct agtatgtatg 2761 aaaattctac aatattgcaa